Diabetologia：激活但功能受损的记忆Tregs在1型糖尿病患者进展缓慢的过程之前逐渐扩展

从第一次造显现家兔自身血清到造显现1改型冠心病临床统计学腹泻的的发展率在学龄前时期就有很好的说明了，多个家兔自身血清阴性的学龄前里有70%在血清转换后10年末患上冠心病，而随访15年的学龄前这一比例缩减到84%。来得之下，占临床统计学1改型冠心病一半以上的改型1改型冠心病的确诊机制还从未获得充分的统计学。

更是加多的人开始常用仍须系统来定义1改型冠心病的的发展：母微在造显现多种家兔自身血清时进入第1期里，造显现血糖诱发时进入第2期里，造显现腹泻时进入第3期里。一些多发家兔自身血清阴性的母微，在1期和2期，的发展较迟，并发展为确诊的1改型冠心病。我们先前说明了了两一组在首次验证到多种家兔自身血清取样后大概10年无冠心病的亦然迟的发展者，这一组病变数目不及，但特性并不说明。随后，我们发现家兔自身抗体特异性CD8+T细胞膜化学反应在的发展缓迟的病变里基本不存在，但在近期确诊和或多或不及的冠心病病变里很容易验证到。这有可能表明，与的发展病变来得，这些病变自身免疫化学反应的调节大幅提高。

早期统计学表明，尽管调节性T细胞膜(Treg)存量正常，但冠心病病变存在一些机制瑕疵，其里除此以外对IL-2的化学反应能力下降。此外，冠心病病变里的现象CD4+T细胞膜有可能对调节更是具抵抗性，平庸为现象T细胞膜的抑制作用减弱，共存产生的Treg和粘液产生的游离Treg，以及抗体境况的CD4+T细胞膜里IL-2化学反应减弱。本统计学的目的是说明了了CD4+调节性T细胞膜(Treg)在一小群亦然缓迟的发展者里的特性，他们的平均年岁为43岁(31-72岁)，随访时间为18-32年。

作法：BOX统计学是一项以人群为基础的纵向统计学，在21岁表列确诊的病变亲属里安全检查1改型冠心病的凶险因素。我们先前说明了了长期缓迟的发展者的特性，他们保持一致多重家兔自身血清阴性大约10年，但从未造显现冠心病的临床统计学腹泻，迟性或非来进行性自身免疫。随后，10名在此之后保持一致无冠心病并愿意提供大量血液取样的缓迟的发展者纳入T和B细胞膜机制分析。在目前的统计学里，8名迟的发展者(SP一组)，里位年岁43岁(31-72岁)，18 - 32岁之间的家兔自身血清阴性。所有的举例来说都东南面1改型冠心病的发展的1期，尽管一些人随后失去了家兔自身血清对某些抗体的施打，然而，一名病变已经东南面2期大概6年，但从未造显现临床统计学腹泻，一名病变被诊断为冠心病，该受试者72岁，在采集实验取样时，其HbA1c升温到53 mmol/mol(7%)，在统计学里对该NAD来进行了单独分析。剥离外周血单个核细胞膜(PBMCs)，运用于多参数流式细胞膜练成和T细胞膜抑制作用试验分析NAD里Treg的基频、特异性和机制。常用FlowSOM和CITRUS(聚类鉴定、表征和回归)来进行无指派聚类分析，分析Treg特异性。

结果：与卫生NAD来得，来自迟的发展微的失忆CD4+T细胞膜的指派聚类推测，转录的失忆CD4+ Treg基频缩减，与糖皮质激素游离的TNFR之外肽(GITR)解读缩减有关。一名HbA1c升温的病变与的发展缓迟者和也就是说的相异一组来得，Treg谱有所不尽相同。机制推断，与卫生NAD来得，来自缓迟的发展微的Treg介导的CD4+现象T细胞膜抑制作用明显受到破坏。平庸为对现象CD4+T细胞膜CD25和CD134解读的抑制作用缩减。

绘造出1 深入的特异性分析推测，CD4+Treg亚改型在迟的发展表头里缩减。由FlowSOM转换成的Treg二楼，聚集地在来自所有NAD的活CD4+CD45RA -细胞膜上。根据标示物解读鉴定造出10个元簇:失忆T细胞膜_1;失忆T cell_2;失忆T cell_3;失忆T cell_4;CD49b失忆T细胞膜;HLA-DR + GITR +失忆T细胞膜;内核Treg_1;内核Treg_2;内核Treg_3;和内核Treg_4。(a)常用9个不尽相同Treg标示转换成的10个元簇的MST。每个路由表象征性一个战斗群(100个战斗群)，更是大的元战斗群(10个元战斗群)在路由表一组周围上色。每个路由表里的饼绘造出说明单个标示的解读高级别。(b)每个元聚类的热绘造出，以推测整微标示解读。(c, d)为HD一组(c)和SP一组(d)转换成绘造出，以及FlowSOM识别的每个元簇的覆盖层。(e-l)一般来说丰度为每个metacluster盒曲本站绘造出(丰度> 0.05%)相符为HD和SP一组:内核Treg_2 (e),内核Treg_3 (f),内核Treg_4 (g), HLA-DR + GITR +失忆T细胞膜(h)、失忆T cell_1(i),失忆T cell_2 (j),失忆T cell_3 (k) n d CD49b失忆T细胞膜(l)。绿色左上角象征性捐助者SP 606。**p< 0.01, Wilcoxon配对记号秩检测。此键适用于绘造出形部分(a)， (c)， (d)和d (e-l)

绘造出2 常用CITRUS的预测模改型得造出结论，Treg基频的缩减是的发展缓迟的logo。分级介导(a - f)和柑橘分析(g-k)比较SP举例来说和也就是说的HD举例来说在CD4+CD45RA−T细胞膜上的差异。(a)杂交CD25+ cd127 lotreg和CD25loCD127+T c e l群微的别具特色绘造出。CD25+ cd127lotreg被CD39和FOXP3氟化物，然后通过HLA-DR和GITR解读来进行剥离，模拟FlowSOM群微。(b) HD(黑点)和SP(布氏)一组以及NADSP 606(绿色)里CD25+ cd127的基频汇总绘造出。(c-f) CD25+CD127loCD39+FOXP3+和CD25loCD127+介导侄集的盒曲本站绘造出;(c) HLA-DRloGITR−(内核Treg_2)， (d) HLA-DRintGITRlo(内核Treg_3)， (e) HLA- d RhiGITR+(内核Treg_4)， (f) HLA- d RhiGITR+(HLA-DR+GITR+内核T cell)。(g - i)柑桔簇螺旋由(g) CD127， (h) CD25和(i) FOXP3解读准确度渐变，圆圈突造出的簇被识别为SP和HD表头之间的不尽相同。(j)盒曲本站绘造出推测了在SP(布氏)和HD(灰点)一组里，CITRUS失忆Treg_3和Treg_4的一般来说丰度(比例)。(k)灰度推测每个簇的特异性(粉红色)和Treg标示一般来说解读与取材解读(蓝色);上列，内核Treg_3;下面一行，内核Treg_4。取材与所有其他簇里标示的解读有关。*p< 0.05， **p< 0.01, Wilcoxon配对记号秩检测

绘造出3 与卫生献血者来得，的发展缓迟者失忆treg的GITR缩减。每个失忆CD4+T细胞膜元簇(失忆T细胞膜_1;失忆T cell_2;失忆T cell_3;CD49b +失忆T细胞膜;HLA-DR + GITR +失忆T细胞膜;内核Treg_2;内核Treg_3;来自FlowSOM的memory Treg_4)验证每个解读标示的变化。(a,b)来自HD (a)和S (b)表头的解读热绘造出(sp606不除此以外在内)。(c,d)失忆Treg_4元簇里所有HD(灰色)、所有SP(蓝色)和SP 606(绿色)的FlowSOM GITR解读串联，推测灰度(c)和汇总绘造出(d)。Wilcoxon配对记号秩和检测，p< 0.07(绿色)所有NAD除此以外，p< 0.05(蓝色)NADSP 606和也就是说的HD不除此以外在测试里。(e,f) HLA-DRhiGITR+Tregs里GITR解读，从分级介导，从所有HD(灰色)、所有SP(蓝色)和SP 606(绿色)串联，推测灰度(e)和汇总绘造出(f) *p< 0.05, Wilcoxon配对记号秩检测

绘造出4 来自缓迟的发展的CD4+ treg细胞膜依靠现象CD4+T细胞膜的能力下降。SP一组用蓝色的本站和左上角说明，HD一组用黑色的本站和左上角说明，绿色的本站/左上角说明NADsp606。常用CD4+CD25+ Treg分选试剂盒对CD4+T细胞膜来进行分选。CD4+CD25−(反之亦然者)被标示为CFSE, Treg按观察的比例试样。用抗CD3 /28微珠转化细胞膜，培训3天后来进行流式细胞膜练成验证。(a-d)与CD4+反之亦然者一般来说应的treg培训(自微)(e-h) HD、SP或SP 606 Treg与HD反之亦然者培训。(a,b,f) CFSE游离(a,e)和CFSE抑制作用比率(b,f)。(c, d,h) CD25 (c,g)和CD134 (d,h)的抑制作用比率。常用阴性相异(转录的响应细胞膜不含treg)计算抑制作用比率。*p< 0.05， **p< 0.01， ***p< 0.001，重复测量双向方差分析。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重比较测试

绘造出5 现象CD4+T细胞膜对缓迟的发展的T细胞膜转化的抑制作用更是敏感。SP一组用蓝色的本站和左上角说明，HD一组用黑色的本站和左上角说明，绿色的本站/左上角说明NADsp606。常用CD4+CD25+Treg分选试剂盒对CD4+T细胞膜来进行分选。CD4+CD25−(反之亦然者)被cfsel标示，treg按观察的比例试样。用抗CD3 /28微珠转化细胞膜，培训3天后来进行流式细胞膜练成(CD25反染)和细胞膜因侄分析。HD Treg与HD、SP或sp606反之亦然者携手培训。(a,b) CFSE游离(a)和CFSE抑制作用百份(b)。(c,d) CD25抑制作用百份(c)和CD134抑制作用百份(d)。(e,f) IFN-γ(e)和IL-17A (f)在共培训里的解读。***p< 0.001， **p< 0.01，重复测量双向方差分析。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重比较测试

结论：我们得造出的结论是，来自缓迟的发展侄的转化失忆CD4+Treg在GITR解读里获得了扩展和丰富，强调了进一步统计学Treg在1改型冠心病风险母微里的异质性的必要性。

原文造出处：

Boldison J, Long AE, Aitken RJ,et al.Activated but functionally impaired memory Tregs are expanded in slow progressors to type 1 diabetes.Diabetologia 2021 Oct 28